ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。      在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。 原理如下： ①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。         操作步驟 　　方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 　　1.　包被：用0.05M PH9.?碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。 　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。 　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。 　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O?D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O?D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。 　　方法二　用于檢測未知抗體的間接法： 　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 　　　　　　每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔 　　　　　　中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照) 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml， 　　　　　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 　　(三)　試劑器材 　　1.　試劑 　　(1)　包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液): 　　　　　　NaCO３1.59克 　　　　　　NaHCO３　 2.93克 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　(2)　洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M 　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克 　　　　　　Na2HPO４?12H2O　　2.9克 　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克 　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克 　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　(3)　稀釋液： 　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 　　　　　　　加洗滌緩沖液至100ml 　　　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。 　　(4)　終止液(2M　H２SO４）： 　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。 　　(5)　底物緩沖液(PH5.0磷酸 檸檬酸): 　　　　0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml 　　　　0.1M 檸檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml 　　　　加蒸餾水50ml。 　　(6)　TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液: 　　　　TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml 　　　　底物緩沖液(PH5.5)　　　 10ml 　　　　0.75％H２O２　　 　32μl 　　(7)　ABTS使用液: 　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg 　　　　底物緩沖液(PH5.5)　 1ml 　　　　3％H２O２　 　2μl 　　(8)　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。 　　(9)　正常人血清和陽性對照血清。 　　2.　器材: 　　(1)　聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。 　　(2)　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。 　　(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。