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簡要描述：霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒注意事項(xiàng)：．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
產(chǎn)品型號：GY-L02109廠商性質(zhì)：更新時間：2023-10-24 00:00:00訪 問 量：607產(chǎn)品分類
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【產(chǎn)品名稱】霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒
【型號：】GY-L02109
【包裝規(guī)格】50次/盒 
【產(chǎn)品及特點(diǎn)】霉菌是真菌的一種，其特點(diǎn)是菌絲體較發(fā)達(dá)，無較大的子實(shí)體。同其他真菌一樣，也有細(xì)胞壁，寄生或腐生方式生存。霉菌有的使食品轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸疚镔|(zhì)，有的可能在食品中產(chǎn)生毒素，即霉菌毒素。自從發(fā)現(xiàn)以來，霉菌與霉菌毒素對食品的污染日益引起重視。對人體健康造成的危害極大，主要表現(xiàn)為慢性中毒、致癌、致畸、致突變作用。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測霉菌通用的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)霉菌通用DNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
7.本產(chǎn)品只能用于科研。
霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒【規(guī)格及成分】
成分 | 規(guī)格 |
A | 500 μL |
B | 1 mL |
C | 1 mL |
D | 150 μL |
E | 50 μL |
使用手冊 | 1份 |
【運(yùn)輸及保存】低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】 樣品 DNA。
【使用方法】一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1.標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同。
3.在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7.如果有N個樣品待提取，設(shè)置N+2個提取，多出的是PC（樣品制備陽性對照）和NC（樣品制備陰性對照）?？梢匀￡栃詫φ盏?000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。
8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)兼容。
三Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR
陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性對照 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管 （1-6 管） |
A | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
D | 3 μL | 3μL | 3 μL |
N+2個待測DNA模板 | 7 μL | - | - |
C | - | 7 μL | - |
第6步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6號） | - | - | 7 μL（1 號樣到 1 號管，2 號樣到 2 號管…） |
過程 | 溫度 | 時間 |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 min |
PCR反應(yīng) （45個循環(huán)） | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 60 sec（采集FAM通道的熒光信號） |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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