改良大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法及鑒定

     目的 建立一種分離大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法.方法 雄性SD大鼠2只,快速取出心臟,去除左室外約1/4層,將剩余心肌組織剪碎至1 mm3大小，用0.1%Ⅱ型膠原酶在37℃水浴中消化20分鐘。消化后的組織懸液經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液以1000 r/min離心5分鐘，棄上清后加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。采用差速貼壁法純化內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于預(yù)先包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO?條件下培養(yǎng)30分鐘后，轉(zhuǎn)移未貼壁細(xì)胞至新的包被培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

    24小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞呈鵝卵石樣鋪展，免疫熒光檢測(cè)顯示約90%細(xì)胞呈CD31陽(yáng)性，Ⅷ因子相關(guān)抗原染色陽(yáng)性率達(dá)85%。透射電鏡下觀察到特征性Weibel-Palade小體，證實(shí)成功分離出微血管內(nèi)皮細(xì)胞。與常規(guī)方法相比，本改良法獲得的細(xì)胞存活率提高至（92.3±3.7）%，且保持血管形成能力達(dá)7代以上。

    該方法通過(guò)優(yōu)化組織處理步驟和純化條件，顯著提高了原代細(xì)胞的得率和純度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性增殖反應(yīng)，低密度脂蛋白攝取實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，符合內(nèi)皮細(xì)胞功能特征。這種穩(wěn)定高效的分離培養(yǎng)體系，為心血管疾病機(jī)制研究和藥物篩選提供了可靠的細(xì)胞模型。