.特異噬菌體抗體的ELISA篩查（單克隆噬菌體ELISA）將目的蛋白片段包被在免疫吸附板上，經(jīng)過5輪的擴(kuò)增-吸附和洗脫。將zui后一輪洗脫得到的噬菌體感染TG大腸桿菌，梯度稀釋菌液鋪氨芐抗性瓊脂板，從分割較好的克隆中隨機(jī)挑選53個進(jìn)行抗原結(jié)合的ELISA分析找到候選的克隆。

（）從瓊脂板（D3）上接種單一克隆到40μl2×TY-AMP-GLU中，振蕩培養(yǎng)37℃（250rpm）過夜。

（2）轉(zhuǎn)移20μl到第2管的40μl2×TY-AMP-GLU，繼續(xù)生長。37℃ 振蕩培養(yǎng)直到OD60nm達(dá)到0.5。

（3）在第2管中加入8μlM3KO7輔助噬菌體。

（4）37℃放30min，然后37℃振蕩h。80g離心0min，抽去上清。

（5）將沉淀重懸于40μl2×TY-AMP-KANA，30℃振蕩培養(yǎng)過夜。

（6）80g離心0min，使用50μl上清用于噬菌體ELISA（方法見上面描述）。

（7）包板，每孔0μl抗原?？乖瓭舛葹?μg/ml（50mmol/L包被，pH9.6，4℃包被過夜）。

（8）用PBS洗一次，用2% BSA-PBS每孔30μl，37℃封閉2h。

（9）用PBS洗一次，加入F6噬菌體上清50μl，用4% BSA-PBS補(bǔ)足0μl。

（0）37℃孵育h，棄去測試液，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（）加入∶50稀釋的HRP-anti-M3單抗偶聯(lián)物，37℃孵育h，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（2）每孔加入0μl顯色液（0μg/mlTMB溶于0mmol/L乙酸鈉中，pH6.0，使用前在50ml的該液中加入30%過氧化氫0μl），放置37℃孵育0min，藍(lán)色形成。

（3）加入50μlmol/L硫酸終止反應(yīng)，顏色變黃。

（4）在OD450nm處讀數(shù)，減去OD650nm讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。

2.交叉反應(yīng)測試（考慮到篩選過程中抗原體系中存在BSA，所以測試抗體對BSA的交叉反應(yīng)情況）

（）包板，每孔0μlBSA。抗原濃度為2%（50mmol/L包被，pH9.6，4℃包被過夜）。

（2）用PBS洗一次，用2% BSA-PBS每孔30μl，37℃封閉2h。

（3）用PBS洗一次，加入F6噬菌體上清50μl，用4% BSA-PBS補(bǔ)足0μl。（4）37℃孵育h，棄去測試液，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（5）加入∶50稀釋的HRP-anti-M3單抗偶聯(lián)物，37℃孵育h，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（6）每孔加入0μl顯色液（0μg/mlTMB溶于0mmol/L乙酸鈉中，pH6.0，使用前在50ml的該液中加入30%過氧化氫0μl），放置37℃孵育0min，藍(lán)色形成。

（7）加入50μlmol/L硫酸終止反應(yīng)，顏色變黃。

（8）在OD450nm處讀數(shù)，減去OD650nm的讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。

3.競爭性抑制實驗候選克隆進(jìn)行競爭性ELISA分析，找到特異的目的克隆。

4.陽性克隆的質(zhì)粒提取在含有篩選功能的培養(yǎng)板（如氨芐抗性或抗性）上挑取單菌落，在含同樣篩選抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。然后用普通的質(zhì)粒提取法提取質(zhì)粒。抗體

5.陽性克隆的菌液或質(zhì)粒送測序