體外神經(jīng)組織細(xì)胞的培養(yǎng)已成為神經(jīng)生物學(xué)研究中十分有用的技術(shù)手段。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)需要*的營養(yǎng)條件，對于底物的選擇也比其他細(xì)胞苛刻。神經(jīng)細(xì)胞在未處理的玻璃或塑料上不能很好地存活，但在膠原蛋白或D一多聚賴氨酸內(nèi)能向外長出軸突。多肽神經(jīng)因子和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的因子促進(jìn)軸突生長。神經(jīng)組織(nervous tissue)由神經(jīng)元(neuron)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(netaroglia cell)組成。神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下難以增殖。因此，目前神經(jīng)元的培養(yǎng)主要用于原代培養(yǎng)。

一、神經(jīng)元的培養(yǎng)

(一)材料

．材料來源新生大鼠腦組織。

2．手術(shù)器械解剖剪、解剖鑷、眼科剪和眼科鑷。

3．24孔培養(yǎng)板和蓋玻片使用前用0．0％PLL處理蓋玻片，室溫過夜。無菌蒸餾水清洗后，紫外線照射滅菌。

4．清洗液HBSS，添加20萬IU／L和200rng／L。

5．消化液O．05％。

6．培養(yǎng)液

()接種培養(yǎng)液：DMEM，添加0％HS O．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60mg／L、孕酮、0萬I U／L和00mg／L。

(2)維持培養(yǎng)液：DMEM，添加5％FBS、0％HS 0．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60nng凡孕酮、0mmol／L丙酮酸鈉、5mg／L胰島素、00mg／L轉(zhuǎn)鐵蛋白、0．％卵白蛋白、0μg／L NGF一β、0萬I U／L和00mg／L。

(二)方法

．取材采用生后l周以內(nèi)的新生大鼠，頸內(nèi)動(dòng)脈放血處死后，取腦組織，置于無菌平皿內(nèi)。然后，用預(yù)冷的HBSS沖洗腦組織3次。在解剖顯微鏡下，剝離軟腦膜和血管，取皮質(zhì)。將皮質(zhì)腦成mm3左右的小塊。

2．消化將組織塊放人0．05％中，在37℃水浴中振蕩消化30min。用吸管輕輕吹打，然后用不銹鋼網(wǎng)濾出組織塊。

3．細(xì)胞懸液制備用HBSS收集組織塊，將組織塊研碎，用吸管反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液。然后，移人5ml離心管中，室溫下靜置0min后棄上清液，重復(fù)沖洗細(xì)胞3次。向離心管內(nèi)細(xì)胞沉淀中加入5ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打，離心(000r／min，lOmin)。

4．培養(yǎng)細(xì)胞棄去上清液，用培養(yǎng)液懸浮沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于培養(yǎng)板中的蓋玻片上，在37℃條件下靜置培養(yǎng)。每隔2～3d換液次。

(三)結(jié)果觀察

    培養(yǎng)24h后，大部分神經(jīng)元已貼壁生長。神經(jīng)元胞體呈圓形或長桿狀，核大而圓，核仁明顯。可見有細(xì)小突起從胞體長出。3～5d后，細(xì)胞突起明顯變長。lOd后，細(xì)胞聚集成束，并開始退化?？捎梦⒐芟嚓P(guān)蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)絲等免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元，培養(yǎng)的細(xì)胞中95％以上為神經(jīng)元細(xì)胞。

(四)注意事項(xiàng)

    培養(yǎng)液中需加入高濃度的葡萄糖，以利于神經(jīng)元的生長。如需維持神經(jīng)元生長較長時(shí)間，可將蓋玻片放在單層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞支持物上進(jìn)行培養(yǎng)。