實(shí)體組織材料的分離方法

    對(duì)于實(shí)體組織材料，細(xì)胞間結(jié)合緊密，可采用機(jī)械分散法和消化分離法使組織中的細(xì)胞寬分分散，形成細(xì)胞懸液。

(一)機(jī)械分散法

    機(jī)械分散法，指通過(guò)各種各樣的物理學(xué)處理手段，將所取得動(dòng)物組織解離成為單個(gè)細(xì)胞藥方法，包括切割分離法和機(jī)械分散法。

．材料

()標(biāo)本：各類實(shí)體組織材料。

(2)試劑：Hanks液、培養(yǎng)液。

(3)器具：手術(shù)刀、眼科剪、不銹鋼(rg龍)的篩網(wǎng)、平皿、三角燒瓶。

2．機(jī)械分散的操作步驟

()切割分離法：無(wú)菌切取cm3一塊組織，置人小燒杯中，左手斜持容器，右手持長(zhǎng)柄眼科剪伸入容器中，反復(fù)剪切組織至lmm3大小，用吸管吸取Hanks液把附著在剪刀上的組織小塊沖下。并再補(bǔ)充適量的Hanks液后，用吸管反復(fù)輕柔吹打片刻，低速離心，棄上清液，余下的組織塊可用于細(xì)胞培養(yǎng)。

(2)機(jī)械分散法：所取標(biāo)本是纖維成分很少的軟組織，如腦組織，部分胚胎組織及一些腫瘤組織。將組織塊處理成小塊后，可將組織放在注射器針管中擠壓或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

(二)消化分離法

    消化分離法是把切成較小體積，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步分散組織的方法。zui后使被處理的組織分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)液后制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)容器中后，細(xì)胞容易生長(zhǎng)繁殖。各種消化劑作用機(jī)制各不相同，根據(jù)組織的不同．可選用特定的消化手段。使用的消化劑包括酶類和非酶EDTA。

．消化分離法種類

()消化法：(簡(jiǎn)稱)是廣泛應(yīng)用的消化劑。對(duì)細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等。適于消化細(xì)胞問(wèn)質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。鈣、鎂離子對(duì)的活性有一定的抑制作用，兇此，采用無(wú)鈣、鎂離子的PBS。一般采用的濃度為0．％～0．25％(活力l：200或：250)。常使用的消化溫度為37℃，消化分離細(xì)胞時(shí)pH適宜選用7．6～8．0之間，否則對(duì)細(xì)胞有損傷。消化5mm3大小的軟組織，消化時(shí)間為20~30min為宜，但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)。可采用冷消化，使用低濃度消化液，于4℃過(guò)夜。

(2)膠原酶消化法：膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，同時(shí)對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，而使細(xì)胞不受傷害。該酶在有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，zui終濃度200U／ml或0．～O．3μg／ml。此酶消化作用緩和，無(wú)需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。

    由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性，經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被*消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此不必要冉進(jìn)一步消化處理。

(3)EDTA消化法：EDTA是一種非酶消化物。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0．02％工作液，對(duì)一些組織．尤其是上皮組織分散效果好。EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。EDTA常不單獨(dú)使用，可與混合使用(：或2：)，不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低的用量和毒性作用。

2．材料

()標(biāo)本：各類實(shí)體組織材料。

(2)試劑：消化液、PBS、Hanks液、培養(yǎng)液。

(3)器具：眼科剪、不銹鋼(尼龍)的篩網(wǎng)；平皿、三角燒瓶、吸管、離心管、培養(yǎng)瓶、載玻片。

3．消化分離法的操作步驟(以消化為例)

()漂洗：將組織塊在三角燒瓶(或平皿)中用無(wú)鈣、鎂PBS液洗2～3次。

(2)剪切：組織塊剪碎，剪成3~5mm。大小的小塊。

(3)消化：剪碎的組織塊放人三角燒瓶中，加入比組織量多30~50倍的0．25％消化液。置于電磁攪拌器臺(tái)上，消化30~60min，或置于37℃水浴鍋(37℃溫箱中)，中間每隔5～0 min可輕搖次，組織塊膨松呈絮狀可終止。如果需要長(zhǎng)時(shí)間的消化可更換一次消化液，靜止三角燒瓶0min，待組織下沉后，吸出2／3上清液，余下／3，再補(bǔ)加新的消化液，繼續(xù)消化。

(4)消化完畢，倒入離心管中，800r／min離心6~8min，去上清液。

(5)漂洗：采用Hanks液漂洗2~3min，離心去上清液，共2次。

(6)低速離心(500~000r／min)：離心5min，去上清液，加入一定量的培養(yǎng)液，通過(guò)00μm的網(wǎng)眼的尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)，以除去未消化的較大組織塊；如果消化*可不用濾過(guò)。用吸管吸取一滴細(xì)胞懸液滴于載玻片上觀察，如果細(xì)胞分散良好，形態(tài)整，即可用于培養(yǎng)。

4．注意事項(xiàng)

()組織塊必須漂洗2～3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)的抑制作用。

(2)濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性，濃度不宜過(guò)高；作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕以避免蓬松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。