溶血空斑形成試驗(yàn)(plaque forming cell assay)是體外檢測(cè)和計(jì)數(shù)B細(xì)胞功能的一種常用方法，即檢測(cè)空斑形成細(xì)胞(plaque-formiilg cell，PFC)，反映B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。當(dāng)B細(xì)胞受抗原或有絲分裂原刺激后，可分化增殖為漿細(xì)胞，并分泌抗體。B細(xì)胞功能減弱或缺陷，可表現(xiàn)為抗體形成細(xì)胞減少及血清Ig量的減少。PFC檢測(cè)方法很多，有瓊脂固相法、蓋玻片法、小室液相法、單層細(xì)胞法等。

.20%SRBC懸液(用Hank’s液配制)。

2．補(bǔ)體取3只豚鼠的新鮮血清混合，取壓積SRBC，按SRBC與豚鼠血清：4～：6的比例加入壓積SRBC，混勻，置4℃冰箱30min，2000r／min離心20min去除SRBC，以吸收豚鼠血清中可能存在的抗SRBC抗體，防止假空斑的出現(xiàn)。

3．底層和頂層瓊脂取抗補(bǔ)體作用小的瓊脂，用PBS配成．4％和O．7％兩種濃度。

4．DEAE右旋糖酐分子量50萬(wàn)，用蒸餾水配成％濃度備用。

(三)方法

免疫脾細(xì)胞懸液的制備

．免疫小鼠：每只小鼠經(jīng)尾靜脈或腹腔注入上述SRB(：懸液ml。

2．制備脾細(xì)胞懸液：將免疫后第四天的小鼠．拉頸處死，解剖取出脾臟，放人含Ca 2+ 、Mg 2+冷的pH值7．2 PBS中漂洗后，去掉結(jié)締組織，加入適量的PBS，用彎頭鑷子擠壓出脾細(xì)胞，稍靜置，吸上清液至離心管中，500r／min離心5min，棄上清液后，定量加入PBS，混勻，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算脾細(xì)胞，zui后用PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)至07／ml的濃度。一般每只脾臟細(xì)胞數(shù)為～．5×08個(gè)。

3．傾注底層瓊脂將．4％瓊脂凝膠經(jīng)加熱融化后，傾注于水平位置的平皿內(nèi)，每皿2～3ml，凝固后，置37℃溫箱，平皿反扣，開(kāi)蓋lh后備用。

4．頂層瓊脂的制備將0．7％的瓊脂融化后，置于45℃恒溫水浴箱中，依次加入：①2×09／ml SRBC懸液O． ml；②％DEAE有旋糖酐0．05ml；③07／ml脾細(xì)胞懸液O． ml。迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂的平皿內(nèi)，使之均勻鋪開(kāi)，凝固后，靜置約5min，放37℃溫育～．5h。

5．加補(bǔ)體從溫箱中取出平皿，每皿加入：30稀釋的新鮮豚鼠血清．5ml(如未加DE—AE右旋糖酐，則加原血清或：5稀釋的新鮮血清．5ml)，繼續(xù)放37℃溫箱中溫育30min后，取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置lh，4℃冰箱過(guò)夜，翌日觀察結(jié)果。

(四)結(jié)果分析

    肉眼觀察可見(jiàn)空斑為邊緣整齊的圓形透明區(qū)，如肉眼難以分辨，可在低倍鏡下鑒定，空斑的有淋巴細(xì)胞，周圍為透明區(qū)。一個(gè)空斑代表一個(gè)PFC，計(jì)數(shù)每塊玻片的空斑數(shù)，算出每個(gè)脾臟中PFC數(shù)。