(一)實(shí)驗(yàn)方法

．細(xì)胞懸液的制備 將生長成單層的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，HBSS洗滌后，用0．02以EDTA或0．％溶液(無Ca 2+ 、Mg 2+之磷酸緩沖液中)37℃消化細(xì)胞。冉用HBSS浼滌次，加入適量生長用培養(yǎng)基，反復(fù)吹吸，制成單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。

2．UDS的放射自顯影顯示法

()將單細(xì)胞懸液接種于置有小蓋玻片(8mmX 6mm)的培養(yǎng)瓶中。37℃培養(yǎng)～3d，使細(xì)胞在蓋玻片上生長至適當(dāng)密度。

(2)改換同步化培養(yǎng)基(ADM補(bǔ)以％小牛血清)作同步培養(yǎng)3－－4d。

(3)在實(shí)驗(yàn)前一日下午，改換含有0mmol／。(HU)的ADM培養(yǎng)基，37℃曩續(xù)孵育6h。

(4)將上述長有細(xì)胞的蓋玻片置于含有待檢樣品或已知致癌物的同步用培養(yǎng)基(含0mmmol／L HU及5～lOμci／ml，30Ci／mmol 3 H一胸腺嘧啶核苷)中，37℃孵育5h。檢品及已知致癌物溶液在實(shí)驗(yàn)時(shí)新鮮配制，以溶劑及已知致癌物為對(duì)照。

(5)孵育結(jié)束后，用HBSS充分洗滌，用％溶液處理0min，隨后用乙醇冰乙酸(3：)固定，4℃過夜。

(6)空氣中干燥后，用少量中性樹膠，將蓋玻片粘固于載玻片上，細(xì)胞面朝上，45℃烘烤24h。

(7)在暗室中，將適量乳膠移入浸漬用玻璃器皿中，置于40℃水浴中令其融化，同時(shí)取等量蒸餾水于量筒中也置于該水浴中加熱，待乳膠融化后，將熱蒸餾水傾于乳膠液中，繼續(xù)在水浴中加溫，并用玻璃棒輕輕攪拌，等待lO～20min，使氣泡逸出。在以上準(zhǔn)備過程中，將待檢玻片置于水浴平臺(tái)上預(yù)熱。準(zhǔn)備就緒后，將玻片垂直浸漬于：稀釋的乳膠液中約5s，徐徐提出玻片，并用紗布或擦鏡紙拭去玻片背面乳膠。

(8)將已涂有乳膠的玻片移入溫度為29℃及一定濕度的溫箱中(4h)待乳膠干涸。

(9)將玻片置于內(nèi)含適量干燥劑(變色硅膠)的曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光紙及塑料紙，置于4℃冰箱中曝光0d。

(0)曝光結(jié)束后，將玻片移人有機(jī)玻璃制成的玻片架上，在液溫為9℃的D一96顯影液中顯影5min，在停顯液中漂洗2min，在F一5定影液中定影6～lOmin，再用水漂洗數(shù)小時(shí)。

()將玻片脫水透明后，用蓋玻片封固。

(2)在顯微鏡下，每個(gè)處理組計(jì)數(shù)各樣本細(xì)胞核上的顯影銀粒數(shù)，同時(shí)計(jì)數(shù)相當(dāng)面積的本底銀粒數(shù)，并自核上的銀粒數(shù)減去。計(jì)數(shù)30～50個(gè)細(xì)胞核。

3．LTDS的液體閃爍計(jì)數(shù)顯示法

()將單細(xì)胞懸液按0．5×05個(gè)／ml濃度接種于液體閃爍計(jì)數(shù)瓶中，每瓶ml，并加入4C一胸腺嘧啶核苷終濃度為O．0μci／ml(50mCi／mmol)。37℃于細(xì)胞增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h使細(xì)胞增殖并預(yù)標(biāo)。

(2)去培養(yǎng)基并用HBSS洗滌后，換以含4c胸腺嘧啶核苷(O．0μci／m)的同步化培養(yǎng)基，37℃進(jìn)行同步化培養(yǎng)2～4d。

(3)實(shí)驗(yàn)前一日下午去培養(yǎng)基，用HBSS充分洗滌后，加入含有濃度為0mm0／L羥基碌(HU)的同步化培養(yǎng)基，37℃孵育6h。

(4)將上述長有細(xì)胞的蓋玻片置于含有Hu及3 H胸腺嘧啶核苷(5μCi／ml，30Ci／mmol)的同步化培養(yǎng)基中，與不同濃度的檢品及已知致癌物接觸5h。檢品及已知致癌物溶液在實(shí)驗(yàn)時(shí)新鮮配制，以溶劑及已知致癌物為對(duì)照。

(5)孵育結(jié)束后，去培養(yǎng)基及檢品。冷鹽水洗滌2次，隨后用冰冷的O．25mol／L過氯酸溶液處理2次，每次2min，以固定細(xì)胞并除去酸可溶性成分。

(6)乙醇處理0min除去脂溶性成分及未摻入的標(biāo)記物，干后以O(shè)．5～lmol／L過氨酸0.5ml，于75～80℃恒溫箱中水解40min，使摻人的標(biāo)記物釋出。

(7)冷卻后加入乙二醇乙醚3．5ml及53ml閃爍液，振搖后使呈勻相，以液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定各樣本中4c及3 H的放射活性。標(biāo)本中的3 H放射活性即反映UDS中3 H一胸腺嘧啶核苷的摻人量；而4 c的放射活性反映實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)目或其DNA量，因此3 H和4c放射活性比(3 H/4 c)即為單位質(zhì)量DNA或單位數(shù)目細(xì)胞中UDS水平的反映值。

二、結(jié)果判斷

    可用Student氏“t”檢驗(yàn)檢測(cè)各檢品與溶劑對(duì)照間有無顯著性差異而作出判斷。

    試驗(yàn)組處理的細(xì)胞3 H一胸腺嘧啶核苷摻人數(shù)隨待檢樣品劑量增加而增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或者zui小劑量組反應(yīng)陽性，與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均可判定為該試驗(yàn)陽性。受試物組處理的細(xì)胞3H一胸腺嘧啶核苷摻人數(shù)不隨待檢樣品劑量增加而增加，任何一個(gè)劑量組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，則認(rèn)為受試物在該試驗(yàn)系統(tǒng)不引起UDS。判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。