實(shí)驗(yàn)原理

     分子生物研究中，zui常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機(jī)引物合成法。ELISA試劑盒

    切口平移法（nick translation） 當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3＇羥基末端。同時(shí)該酶具有從5＇→3＇的核酸外切酶活性,能從切口的5＇端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3＇端補(bǔ)上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng),用放射性核苷酸代替原先無(wú)放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小ui合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: （a） 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。（b） DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。（c） DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。

實(shí)驗(yàn)試劑

（） 0×切口平移緩沖液:  0.5M/L Tris-Cl （pH7.2）；  0.M/L MgSO4； 0mM/L DTT；  00ug/ml BSA。

（2） 未標(biāo)記的dNTP原液：除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mM/L Tris·Cl （pH7.5）溶液中,濃度為0.3mM/L。ELISA試劑盒

（3） [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 0uCi/ul。

（4）E.coli DNA聚合酶Ⅰ：（4單位/ul）：溶于50ug/ml BSA, mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl（pH7.5）中。

（5） DNA酶:mg/ml。

（6） EDTA :200mM/L （pH8.0）。

（7） 0M/L NH4Ac。

實(shí)驗(yàn)步驟

（） 按下列配比混合:未標(biāo)記的dNTP 0ul   0×切口平移緩沖液 5ul    待標(biāo)記的DNA ug

[α-32 P]dCTP或dATP（70uCi） 7ul    E.coli DNA聚合酶 4單位    DAN酶 I ul

加水至終體積 50ul

 （2） 置于5℃水浴60分鐘。

 （3） 加入5ul EDTA終止反應(yīng)。

 （4） 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5M/L, 加入兩倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀回收DNA探針。

注意事項(xiàng)

、3H，32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。

2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長(zhǎng)度比較短。ELISA試劑盒