谷研試劑-雞蛋中蛋白活性物的分離方法研究

雞蛋由蛋殼、蛋清和蛋黃三部分組成，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富，易被人體消化吸收的食物。對(duì)雞蛋的研究與應(yīng)用，以前多局限于對(duì)鮮蛋貯存保鮮及其營(yíng)養(yǎng)成分和某些物理性質(zhì)(如乳化性和起泡性等)進(jìn)行開發(fā)利用，生產(chǎn)的產(chǎn)品比較單一，產(chǎn)品主要有冰蛋、蛋粉、松花蛋、蛋黃醬、蛋白片等。近年來，隨著蛋品研究的深入和分離技術(shù)的提高，人們發(fā)現(xiàn)雞蛋中含有丈量具有生物活性的成分，如免疫球蛋白。蛋黃可以看作是一種蛋白溶液中含有多種懸浮頸拉的復(fù)雜腔體體系，這些懸浮顆粒中主要含有脂肪、脂蛋自，卵黃磷脂蛋白等。蛋白溶液中剛含有卵黃球蛋白和低密度脂蛋白等。卵黃球蛋白經(jīng)電泳可得α-、β-、γ-三種組分。卵黃球蛋自，其在免疫學(xué)方面與雞血清IgG一致。由于其在蛋黃中特異性存在，其蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)等方面與哺乳動(dòng)物IgG存在一定差異，所以在比較免疫學(xué)領(lǐng)域把由雞蛋黃中獲得的抗體稱作IgY(ImmunoglobuIin Yolk)。IgY在分類上仍屬于96型免疫球蛋白，分子量比哺乳動(dòng)物IgG的大，約為50000d,系由兩條重鏈(Heavy Chain)和兩條輕鏈(Light Chain)通過一S一鍵聯(lián)接在一起呈γ型結(jié)構(gòu)的大分子蛋白。

自893年Klemperer發(fā)現(xiàn)親代雞通過雞蛋向幼雛轉(zhuǎn)移母源抗體以后至960年問，科學(xué)家們對(duì)各種抗原(細(xì)菌、病毒、蛋自質(zhì)等)引起親代雞產(chǎn)生特異性抗體然后向雞蛋黃中轉(zhuǎn)移并蓄積的情況進(jìn)行了許多研究。IgY特異性存在于蛋黃中，在雞蛋孵化時(shí)轉(zhuǎn)移戮幼雛血液中。對(duì)幼雛生長(zhǎng)初期抵抗疾病起著重要作用。

雞蛋黃IgY晟初的應(yīng)用領(lǐng)域主要包括免疫學(xué)診斷和醫(yī)藥兩方面：一方面應(yīng)用于病毒的診斷、特定分子的洳定、食品摻假及殘留分析、測(cè)定復(fù)雜分子的結(jié)構(gòu)和功能等；另一方面作為醫(yī)藥制劑，被用于處理感染性腹瀉、防止齲齒等；此外據(jù)ThaJly和Carrol報(bào)道lgY還可以用于抗血毒。

八十年代后，隨著口服被動(dòng)免疫(Oral Passive Iramunonization)的開發(fā)日益受消費(fèi)者關(guān)注，IgY開始被當(dāng)作功能性食品成分單獨(dú)使用或添加到食品中應(yīng)用。通過口服特異性特異性抗體IgY，作用于病原體，以達(dá)到口腔及消化道感辯性疾病的預(yù)防與洽療。尤其對(duì)那些不能產(chǎn)生主動(dòng)免疫應(yīng)答(active immune respOnse)的個(gè)體，如新生兒、有獲得性免疫缺乏癥的兒童，以及由于化學(xué)治療、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)或老年化引起免疫功能下降的兒童或老人等，在其食品中添加免疫抗體顯得尤為重要。雞蛋中脂質(zhì)與蛋白質(zhì)之比約為2：，其中大部分脂類和蛋白質(zhì)相結(jié)合以脂蛋白的形式存在。這些脂蛋自多數(shù)存在于蛋黃顆粒中，一部分與卵黃球蛋白(包括IgY)同時(shí)存在于蛋黃漿狀液中，因此，IgY的提純zui重要的一步是去除脂和脂蛋白。

早先IgY主用于免疫學(xué)研究和臨床試驗(yàn)等方面，初步脫脂分離常用一些有機(jī)試劑，如氯仿。丙酮、丙烷-2-醇等，試劑用量大，成本昂貴。八十年代后隨口服被動(dòng)免疫的日益受消費(fèi)者重視，需要大規(guī)模生產(chǎn)IgY，于是一些新的分離方法被開發(fā)出來。如：

IgY的分離方法

.水稀釋法：簡(jiǎn)單的水稀釋法可用于蛋黃液中親水性部分和疏水性部分的分離。即將蛋黃液稀釋一定倍數(shù)，調(diào)節(jié)溶液pH值，混勻靜置后離心分離或長(zhǎng)時(shí)間靜置分離。該法生產(chǎn)成本低，適于規(guī)?；a(chǎn)，但由于IgY被稀釋．給后期提純?cè)黾恿艘欢ɡщy。

.2 脂蛋白凝聚劑法：脂蛋白凝聚劑包括聚乙烯乙二醇、葡聚糖硫酸鈉鹽、酪蛋白鈉鹽、聚丙烯樹脂和一些食品增稠劑，如卡拉膠．黃原膠等。這類物質(zhì)能有效沉集蛋黃中脂與脂蛋白．但通常需要超速離心分離。Hajime Hatta等在比較一些天然股對(duì)蛋黃臘蛋白的沉集作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)入-卡拉膠可沉集99．5％的臘和脂蛋白，而且普通低速離心(600g)就可達(dá)到很好的分離效果。

.3 乙醇-CO2超臨界脫脂法：即先用乙醇將蛋黃粉中大部分磷臘質(zhì)除去，然后用超臨界CO2將中性脂肪和殘留的乙醇等同時(shí)提出除去。該法IgY活性沒有損失，制得的含抗體的蛋白混合物是干燥狀態(tài)的，易保存。而且可將蛋黃中與色香味有關(guān)的卵黃脂類*除去．適于IgY濃縮蛋白分末(IgY純度約l0％)的大量制造。

.4重復(fù)凍融脫脂法：利用蛋黃脂質(zhì)在低離子強(qiáng)度和中性pU條件下的凝集作用將蛋黃水溶液反復(fù)進(jìn)行冷凍和解凍，以加速脂質(zhì)的凝聚作用，之后進(jìn)行離心分離。此法回收率不高(50％以上)，但較經(jīng)濟(jì)。

.5 有機(jī)溶劑脫脂法：即用事先預(yù)冷至-20℃的有機(jī)溶劑．如乙醇等與蛋黃液混勻，反復(fù)多次漫提其中脂類物質(zhì)。該法所制IgY的純度高，回收率高．但有機(jī)溶劑用量大、成本贏。不適于規(guī)?；a(chǎn)，另外如果預(yù)冷不夠，有機(jī)溶劑會(huì)使IgY部分變性。

雞蛋黃經(jīng)初步脫脂分離后，可得到一個(gè)基本上是水溶性蛋白的混合溶液和一個(gè)主要由脂和脂蛋白組成的沉淀物。要得到純度較高的IgY，則裔進(jìn)—步純化除去蛋白溶液中的雜蛋白。常見的蛋白質(zhì)純化方法有鹽析、乙醇沉淀、凝腔過濾、陰離子交換柱分離和超濾等。通常將其中幾種方法結(jié)合使用，也有用同一種方法而使用不同分離條件進(jìn)行分離。

2的分離提純

除在食品工業(yè)中使用具有一定的潛力外，在臨床上同樣也具有巨大的使用潛力?？杀挥靡蕴幚砀腥尽?、潰瘍以及作為一些抗生素的增效劑，還有血液凝固和止血作用，以及組織再生和瘢痕形成促進(jìn)作用。另?yè)?jù)報(bào)道，還可以通過和一些病毒形成不溶性聚合物而使病毒失活。

是一種N-乙酰脆壁粘肽水解酶，它可以永解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-葡萄糖胺之間的β-(，4)糖苷鍵，而肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分。但如果細(xì)胞壁肽聚糖的外部被一些囊狀多聚體包被或被其他化學(xué)基團(tuán)替代，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的作用就會(huì)降低或被抑制。還可以作用于其他一些聚合。在食品中使用給于二十世紀(jì)60年代，是在建立起有效的工業(yè)化分離提純方法后才得以實(shí)現(xiàn)的，目前已知的可工業(yè)鈀分離的方法有以下幾種：

2.等電點(diǎn)鹽析法

等電點(diǎn)鹽析法是提取的經(jīng)典方法，在蛋清溶液中加入5％的NaCl并調(diào)節(jié)溶液pH值至9.5，靜置結(jié)晶。該法回收率可達(dá)60-80％，但由于大量NaCl的加入影響了剩余蛋清蛋白的應(yīng)用。

2.2離子交換樹脂分離法

Li—Chan等用弱酸性大孔離子交換樹脂C-464從蛋清溶液中吸附，然后用NaCl洗脫。回收率可達(dá)90％-95％。該法zui大的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)污染蛋清中的剩余蛋白。而且可以進(jìn)行批量和連續(xù)生產(chǎn),經(jīng)過改進(jìn)，此法可同時(shí)提取和抗蛋白。目前。國(guó)內(nèi)也開始利廂一些國(guó)產(chǎn)大孔徑弱酸性離子交換樹儲(chǔ)取蛋殼殘留蛋白中提取。

2.3親和色譜法

將幾丁質(zhì)、殼聚糖等可作用的底物固定在一定載體上或直接作為柱材，利用和底物之間的專一縫結(jié)合，將從蛋清中分離。該法生產(chǎn)的純度高可達(dá)70，400U／mg蛋白，回收率為82％。但是該法所用的親和支持物的成豐高。

2.4反膠束法

利用分子量小和PI值高于蛋清中其它蛋白的特點(diǎn)，調(diào)節(jié)蛋清瘩液的pH值至微堿性，使帶正電荷而其它蛋白帶負(fù)電荷，這樣就可以選擇性地進(jìn)入陰離子表面活性劑形成的反膠束中，與其它蛋白分離。該法萃取率高但需加入有機(jī)溶和表面活性劑，易造成剩余蛋白的污染。

2.5其它方法

除上述分離方法外，膜分離技術(shù)也被用于的分離提純，但只能生產(chǎn)活性比較低的粗提產(chǎn)品。